วีดีโอ: จุดประสงค์ของการทำให้ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์คืออะไร?
2024 ผู้เขียน: Miles Stephen | [email protected]. แก้ไขล่าสุด: 2023-12-15 23:41
การทำให้บริสุทธิ์ ของ DNA จาก a PCR โดยทั่วไปแล้วปฏิกิริยาจำเป็นสำหรับการใช้ปลายน้ำ และอำนวยความสะดวกในการกำจัดเอ็นไซม์ นิวคลีโอไทด์ ไพรเมอร์ และส่วนประกอบบัฟเฟอร์ ตามเนื้อผ้า ทำได้โดยใช้วิธีการสกัดแบบอินทรีย์ เช่น การสกัดฟีนอลคลอโรฟอร์ม ตามด้วยการตกตะกอนของเอทานอล
คำถามคือ เหตุใดจึงจำเป็นต้องทำให้ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์?
คุณต้อง ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์ เพื่อกำจัดไพรเมอร์ นิวคลีโอไทด์ และเอ็นไซม์ที่ไม่ได้ใช้ เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพความสำเร็จของ ligation ซึ่งจะรักษาและจัดลำดับ ผลิตภัณฑ์ ของ PCR . ถึง ชำระล้าง NS ผลิตภัณฑ์ PCR , ใช้โครมาโตกราฟีแบบยกเว้นขนาด
นอกจากนี้ ฉันควรทำอย่างไรหลังจาก PCR? เพื่อให้ฟื้นตัวได้สูงสุด ให้ล้างถ้วยที่กักไว้สองครั้งด้วย 10 ถึง 20 µL TE หรือน้ำ สุดท้าย PCR ปฏิกิริยาอาจมี DNA ที่ขยายขนาดสูงถึงไมโครกรัม ซึ่งสามารถนำไปใช้ในการประยุกต์ใช้ทางอณูชีววิทยาได้หลากหลาย การใช้งานเหล่านี้อาจมีความไวมากหรือน้อยต่อส่วนประกอบที่เหลือของ PCR ปฏิกิริยาผสม
อาจมีคนถามว่า คุณทำความสะอาดผลิตภัณฑ์ PCR อย่างไร?
วิธีการแบบคลาสสิกที่ใช้เพื่อ ทำความสะอาด ขึ้น ผลิตภัณฑ์ PCR ก่อนการจัดลำดับรวมถึงเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส การตกตะกอนของเอทานอล และคอลัมน์โครมาโตกราฟี แม้ว่าจะค่อนข้างมีประสิทธิภาพ แต่วิธีการเหล่านี้อาจกลายเป็นเรื่องยุ่งยากได้อย่างรวดเร็วเมื่อทำการประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกันและแสดงระดับการสูญเสียตัวอย่างที่แตกต่างกัน
ทำไมจึงต้องล้าง DNA
เรา ทำความสะอาด ขึ้น ดีเอ็นเอ จากสารละลายที่เป็นน้ำเพื่อขจัดบัฟเฟอร์เกลือ เอนไซม์ หรือสารอื่นๆ ที่อาจส่งผลต่อการใช้งานปลายน้ำ ตัวอย่าง ได้แก่ ปฏิกิริยา PCR ทำความสะอาด ขึ้น, ทำความสะอาด ขึ้นหลังจากการย่อยข้อ จำกัด และ ทำความสะอาด ขึ้นของจีโนมหรือพลาสมิด ดีเอ็นเอ ปนเปื้อนด้วยโปรตีนเซลล์/เศษซาก
แนะนำ:
ไพรเมอร์ใน PCR มีหน้าที่อะไร?
ไพรเมอร์ PCR เป็นชิ้นส่วนสั้นๆ ของ DNA สายเดี่ยว (ความยาว 15-30 นิวคลีโอไทด์) ที่ประกอบกับลำดับดีเอ็นเอที่ขนาบข้างบริเวณเป้าหมายที่สนใจ จุดประสงค์ของไพรเมอร์ PCR คือการจัดให้มีกลุ่ม 3'-OH "ฟรี" ซึ่ง DNA polymerase สามารถเพิ่ม dNTP ได้
มี DNA กี่ชุดหลังจาก PCR 10 รอบ
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) จำนวนชิ้น DNA ที่มีเกลียวคู่จะเพิ่มเป็นสองเท่าในแต่ละรอบ ดังนั้นหลังจาก n รอบ คุณจะมีสำเนาดีเอ็นเอ 2^n (2 ยกกำลัง n:th) ตัวอย่างเช่น หลังจาก 10 รอบ คุณมี 1024 สำเนา หลังจาก 20 รอบ คุณจะมีประมาณหนึ่งล้านเล่ม ฯลฯ
มีวิธีอื่นในการทำให้ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์หรือไม่?
สำหรับการใช้งานที่ต้องการการล้าง PCR หรือการตรวจสอบผลลัพธ์ PCR โดยทั่วไปมีสองวิธีที่ปฏิบัติตาม: การแยกผลิตภัณฑ์ PCR โดยใช้คอลัมน์ และการทำให้เจลบริสุทธิ์จากเจล agarose
วัฏจักร PCR คืออะไร?
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสหรือ PCR เป็นเทคนิคในการทำสำเนาหลายชุดของบริเวณ DNA ที่เฉพาะเจาะจง ในหลอดทดลอง (ในหลอดทดลองแทนที่จะเป็นสิ่งมีชีวิต) ใน PCR ปฏิกิริยาจะถูกหมุนเวียนซ้ำๆ ผ่านการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิหลายชุด ซึ่งทำให้สามารถผลิตสำเนาของพื้นที่เป้าหมายได้จำนวนมาก
รีเอเจนต์ที่จำเป็นสำหรับ PCR คืออะไร และแต่ละรีเอเจนต์มีหน้าที่อะไร?
มีรีเอเจนต์พื้นฐานหรือส่วนผสมห้าชนิดที่ใช้ใน PCR: template DNA, PCR primers, nucleotides, PCR buffer และ Taq polymerase โดยทั่วไปจะใช้ไพรเมอร์เป็นคู่ และ DNA ระหว่างไพรเมอร์ทั้งสองจะถูกขยายระหว่างปฏิกิริยา PCR